Né d'un père architecte et d'une mère coloriste et danseuse, Romain Duris étudie les arts appliqués mais abandonne la peinture pour se tourner vers la musique. Il crée un groupe de jazz-funk-rap puis l'abandonne aussi. C'est un peu par hasard qu'il se tourne vers le métier d'acteur. Découvert à la sortie des cours par le directeur de casting de Cédric Klapisch, il ne voulait pas devenir acteur et n'était pas franchement motivé pendant son premier casting.

Le rôle qui l'a fait découvrir est celui qu'il a tenu dans le film de Cédric Klapisch Le Péril jeune (1994), tourné au départ pour Arte qui voulait des téléfilms sur les années lycée. Il a par la suite collaboré plusieurs fois avec le réalisateur (qui a souhaité entretenir avec lui une relation comparable à celle de François Truffaut avec Jean-Pierre Léaud) : Chacun cherche son chat, Peut-être, L'Auberge espagnole, Les Poupées russes, Paris. Il a aussi collaboré plusieurs fois avec Tony Gatlif (Gadjo Dilo, pour lequel il a été nommé espoir masculin aux césars, je suis né d'une cigogne et Exils) et Olivier Dahan (Déjà mort en 1998, puis dans le clip de Faut que j'travaille de Princesse Erika en 1995 et Le Petit Poucet en 2001). Mais il qualifie sa relation avec Cedric Klapisch de « différente » de celle qu'il avait eue avec ces deux cinéastes.

Romain Duris vit en couple avec l'actrice Olivia Bonamy avec qui il a un fils, Luigi, né le 10 février 2009.

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