Après un Deug d’anglais, elle étudie au Cours Périmony puis au Conservatoire, et débute au cinéma dans Les Gens qui s’aiment de Jean-Charles Tacchella. En 2001, elle tient le rôle principal du film Leïla de Gabriel Axel, puis enchaîne l’année suivante avec Le Frère du guerrier de Pierre Jolivet pour lequel elle obtiendra une nomination au César du meilleur espoir féminin. Elle ressort diplômée en 2002 du Conservatoire national supérieur d'art dramatique de Paris.

En 2003, elle joue dans La Fleur du mal, une chronique bourgeoise de Claude Chabrol. Elle obtient cette même année le Prix Suzanne-Bianchetti. En 2004, on la retrouve dans le film espagnol El Lobo aux côtés d’Eduardo Noriega. En 2005, Mélanie Doutey joue le rôle titre dans la série télévisée Clara Sheller, qui la révèle concrètement au grand public. Malgré le grand succès de cette série (six millions de téléspectateurs sur France 2), Mélanie ne reprend pas son rôle pour une deuxième saison, préférant privilégier sa carrière au cinéma et au théâtre.

En 2006 on la retrouve sur le grand écran dans Président de Lionel Delplanque aux côtés d’Albert Dupontel, dans Fair Play avec Marion Cotillard et Benoît Magimel ainsi que dans la comédie musicale On va s'aimer d’Ivan Calbérac. En 2007, Mélanie Doutey revient au théâtre dans la pièce Confidences trop intimes aux côtés de Jacques Gamblin. Elle est aussi à l’affiche de la comédie romantique Ce soir je dors chez toi ainsi que du téléfilm allemand Troie, la cité du trésor perdu, diffusé sur Sat.1, et qui fut entièrement tourné en anglais.

En 2008, Mélanie Doutey tourne dans Une femme à abattre, puis participe aux films Le Bal des actrices de Maiwenn et Rien de personnel de Mathias Gokalp (2009) qui furent bien reçus par la critique. Fin 2009, Mélanie partage l’affiche avec Kad Merad pour le film d’aventures R.T.T.

Elle est à l'affiche du film Une petite zone de turbulences en 2010 d’Alfred Lot, avec Michel Blanc et Miou-Miou.