Lee Wilkof a tenu ses rôles les plus marquants à Broadway dans «She Loves Me», «Assassins», «Sweet Charity» et «The Front Page». Familier du circuit off-Broadway, il y a notamment joué «Little Shop of Horrors» et «Golden Boy», et a aussi participé à des spectacles régionaux comme «A Funny Thing Happened On The Way To the Forum». On a pu le voir dans Héros malgré lui de Stephen Frears, Blessures secrètes de Michael Caton-Jones et The Associate de Donald Petrie, ainsi que dans des séries comme «Dream On», «Pour l’amour du risque» et «Newhart». Plus tard, il a tenu des rôles réguliers dans «100 Centre Street», «Ally McBeal», «New York - Police judiciaire» et est apparu dans «FBI - portés disparus», «Curb Your Enthusiasm» et «À la maison blanche».

Il a ensuite incarné Marvin Mamoulian dans le biopic sur Howard Stern Parties intimes réalisé par Betty Thomas, tenu le rôle de Carl dans Addicted to Love de Griffin Dunne, celui de Morris dans The Grey Zone de Tim Blake Nelson et celui de Mr. Green dans Rock Academy de Richard Linklater.