Robert Vaughn est élevé par ses grands parents à Minneapolis, dans le Minnesota, Il y étudie le journalisme à l'Université, puis sort diplômé en Sciences Politiques de la State College de Los Angeles. Il débute au cinéma en 1956 comme figurant, aux côtés de Charlton Heston et Yul Brynner, dans Les Dix commandements de Cecil B. DeMille Après avoir participé à de nombreuses séries télévisées, il commence à devenir célèbre en 1960, grâce aux réalisateur John Sturges qui lui confie le rôle de Lee dans Les Sept mercenaires, aux côtés de Yul Brynner, Steve McQueen et Eli Wallach. La même année, il obtient une nomination à l'Oscar pour son interprétation dans Ce monde à part, face à Paul Newman.
En 1964, il devient très célèbre et obtient une nomination aux Golden Globes, grâce à la série « Des agents très spéciaux», où il joue le rôle de Napoléon Solo aidé par Ilya Kuryakin ( David McCallum) et de Alexander Waverly ( Leo G. Carroll). Un peu boudé par les grands studios, il s’engage dans plusieurs actions politiques et publie en 1972 un ouvrage fondamental sur La Chasse aux Sorcières à Hollywood au temps du maccarthysme, Only Victims. Un geste fort que le monde du cinéma ne lui pardonnera jamais complètement… En 2004, au festival de télévision de Monte-Carlo, il est en course pour la nymphe d'or du meilleur film Tv, pour la série « Hustle» où il interprète Albert Stroller aux côtés d' Adrian Lester et Marc Warren. Comme il le dit lui-même: «...j'ai passé mon temps à être bien payé pour être constamment frustré… ». L'auto-critique du comédien est plutôt sévère, car il a malgré tout imposé sa présence glaciale dans plusieurs films, comme Bullitt ou Superman III.