Né dans une famille ayant des origines juive de son côté parternel et chrétienne de son côté maternel originaire d'Autriche, de Pologne, et de Russie; Eli Roth a toujours été passionné par les films d'épouvante. À 11 ans à peine il "démembrait" ses frères dans sa première création vidéo Splatter on the Linoneum. Il créa une cinquantaine de courts métrages avec ceux-ci. Il sort de l'université de New York en 1994 (option cinéma) et reçoit plusieurs prix pour divers films d'animations. En 1999, il crée Chowdaheads une série créée pour Mandalay entertainment et WCW Wrestling. Il réalise, produit et anime une WCW Monday nitro, la sérié la plus suivie de la chaine TNT.

En 2000, il crée en stop motion la série "The Rotten Fruit" (série saluée par notamment le LA Times, Variety et Time magazine). Il cofonde cette année-là le studio d'animation : "The Snake Pit". En tant que producteur, il travaille sur différents courts métrages pour David Lynch. Dans ce contexte, il donne la réplique à Naomi Watts (The Ring, King Kong...).

En 2002 , il sort Cabin Fever qui le fera connaître au grand public et qui le fait remarquer par le monde du cinéma. Le scénario de ce film fut écrit en 1995 avec Randy Pearlstein alors que Roth travaillait comme assistant de direction chez Howard Stern.

En 2005, avec le soutien de Quentin Tarantino, il sort Hostel qui sera un succès au niveau des entrées. Grâce a ce succès, il réalise la suite Hostel - chapitre 2, toujours produit par Tarantino. Roth se retrouve dans plusieurs projets de Quentin Tarantino. Il réalise une fausse bande annonce Thanksgiving dans Grindhouse, joue un petit role dans Boulevard de la Mort, avant de le retrouver en 2009 dans un des rôles principaux de Inglourious Basterds.