Sa première apparition sur scène a lieu au Conservatoire sous la direction d'Aurélien Recoing. Elle est remarquée par Antoine Vitez qui lui confie un rôle dans Hippolyte de Robert Garnier au Théâtre national de Chaillot. Plus tard, elle joue à Bobino sous la direction de Daniel Mesguich, avant de participer aux représentations d'une pièce de Marivaux et d'une autre de Kafka, Le terrier, mises en scène par Frédéric Keppler.

Très vite, le cinéma fait appel à elle : Jean-Loup Hubert lui confie son premier rôle dans L'Année prochaine... si tout va bien avec Isabelle Adjani, Thierry Lhermitte et Marie-Anne Chazel. Jean Becker lui confiera le rôle d'Éliane enfant (le personnage adulte étant joué par Isabelle Adjani) dans L'Été meurtrier, où elle donne la réplique à Michel Galabru. Elle apparait aussi sur petit écran, dans Le Noël de Maigret et Double Face, avant de participer au feuilleton La Famille Ramdane.

Francis Girod lui confie alors le premier rôle féminin dans Lacenaire où elle a pour partenaire Daniel Auteuil. Puis Hervé Palud lui propose le rôle titre de La Gamine où elle partage l'affiche avec Johnny Hallyday. Après le début de sa liaison avec Luc Besson elle arrête sa carrière durant plusieurs années et vit aux États-Unis. Elle tient un petit rôle (créditée sous le nom de "Ouin-Ouin") dans Léon, dont elle réalise le making-of, et interprète sous un épais maquillage le personnage de la Diva Plavalaguna du Cinquième élément de Luc Besson. Après sa rupture avec Luc Besson, elle reprend progressivement sa carrière d'actrice et écrit un one-woman-show en grande partie autobiographique, Le Pois chiche, qu'elle interprète au Café de la Gare. Le spectacle remporte un succès public et critique[10].

Elle tente ensuite une autre expérience en acceptant de tourner dans un film d'horreur d'Alexandre Aja, Haute Tension, avec Cécile de France. Ce film devient un gros succès aux États-Unis. Dans Les Parisiens et Le Courage d'aimer de Claude Lelouch, elle interprète une jeune chanteuse cynique. Poursuivant son activité de scénariste, Maïewenn Le Besco écrit son premier court-métrage I'm an actrice, qu'elle décide finalement de réaliser. Le film est interprété par sa fille Shanna Besson, la fille qu'elle a eue avec le réalisateur Luc Besson.

Elle a réalisé son premier long métrage : Pardonnez-moi, sorti en France en novembre 2006, qu'elle a écrit, produit, réalisé et dont elle tient le rôle principal : Violette. Le procédé est original : écrit et tourné comme si c'était un documentaire autobiographique, le film montre la révolte d'une jeune femme contre son père qui autrefois la battait. Elle obtient pour ce film deux nominations aux César 2007 : celui du meilleur espoir féminin et celui du meilleur premier film.

Son deuxième long métrage, Le Bal des actrices, sorti en 2009, réunit de très nombreuses comédiennes pour une comédie sur la face cachée des actrices. Chacune interprète une chanson d'un compositeur attitré. Gabriel Yared a supervisé la musique. Le rappeur Joey Starr y fait alors ses débuts comme acteur avec un rôle de papa-poule contrastant avec son image de rebelle, et obtient pour sa prestation une nomination au César du meilleur acteur dans un second rôle en 2010. Le film est remarqué par la critique et reçoit le premier Prix Henri-Langlois, tout en rencontrant le succès auprès du grand public avec 200 000 entrées avant la deuxième semaine, avec 116 copies.

Elle préside le jury pour l'attribution du prix Cartier du Festival de Deauville 2009 et remet la palme au film The Messenger.